白介素4和13诱导突变的Dystrophin Pre-mRNA的外显子跳跃以恢复Dystrophin的产生gydF4y2Ba

杜氏肌营养不良症(DMD)是一种由无义或框外缺失突变引起的致死性肌肉退行性疾病gydF4y2BaDMDgydF4y2Ba编码Dystrophin的基因[1][2,3]。虽然多种改善疾病症状的治疗策略正在开发中，但目前还没有治愈方法。在这里，我们报告了一个意想不到的发现，肌内注射抗炎白细胞介素4或13 (IL4/13)不仅可以减轻炎症，还可以恢复肌萎缩蛋白的产生gydF4y2BamdxgydF4y2Ba小鼠模型[4]。IL4/13通过诱导抗营养不良蛋白的改变来恢复抗营养不良蛋白的产生gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba排除突变外显子并恢复阅读框的pre-mRNA剪接模式。我们进一步表明，全身给药IL4-Fc可以恢复多肌群的肌营养不良蛋白，并增加肌肉耐力和力量gydF4y2BamdxgydF4y2Ba老鼠。重要的是，IL4/13的治疗gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞足以诱导外显子跳跃和恢复gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba阅读框gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．此外，il4处理的DMD患者成肌细胞在移植后产生dystrophin阳性肌纤维。鉴于IL4治疗已确立的临床安全性[5,6]，我们建议IL4作为治疗杜氏肌营养不良的首选药物。gydF4y2Ba

DMD是一种毁灭性的遗传疾病，始于儿童早期的肌肉无力，最终因进行性肌肉损失而致命。在骨骼肌中，主要gydF4y2BaDMDgydF4y2Ba亚型由79个外显子组成，编码一个427 kD的Dystrophin蛋白[2,3]。肌萎缩蛋白是一种连接肌动蛋白骨架与肌膜和细胞外基质的结构蛋白，保护肌肉不变性。的gydF4y2BamdxgydF4y2Ba小鼠携带同源基因23外显子(e23)无义突变gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba基因，已成为研究DMD[4]的宝贵模型。该模型也可作为评价转译前研究的基准。目前最有希望的翻译前方法是利用CRISPR技术删除突变的外显子来恢复阅读框[9,10]。然而，CRISPR介导的治疗可能需要数年的安全性评估，因为在高度异质的患者基因组中可能会出现意想不到的脱靶效应。因此，改进目前正在开发的方法和寻找新的策略仍然是高度优先的[11]。gydF4y2Ba

因为外显子在中间gydF4y2BaDMDgydF4y2Ba[12]基因座在很大程度上是可有可无的，目前的方法旨在通过各种途径表达内部截断的Dystrophin[13,14]。据估计，80-90%的DMD患者可以从单个或多个外显子跳过事件中受益，以恢复阅读框并表达内部截断的反营养因子[15]。基于此，使用剪接位点阻断反义寡核苷酸强制排除突变外显子恢复阅读框的临床试验[16]。DMD的疾病进展还伴有慢性炎症，各种抗炎治疗已被用于改善肌肉病理[17]。IL4及其密切相关的IL13是抗炎白介素[18]，两者都被证明能促进成肌细胞融合gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(19、20)。IL4还通过纤维脂肪生成祖细胞促进肌肉再生gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba[21]。因此，我们假设IL4或IL13治疗应该具有抑制炎症和增强肌肉再生的双重好处gydF4y2BamdxgydF4y2Ba鼠标。gydF4y2Ba

目的:研究il - 4和il - 13在前列腺癌中的作用gydF4y2BamdxgydF4y2Ba在小鼠实验中，我们分别将PBS注入右腿胫前肌(TA)，并将PBS注入相同动物的左胫前肌(图1a)。因为gydF4y2BamdxgydF4y2Ba小鼠[4]在出生后约3周出现病理，我们选择在出生后第2周进行早期干预(每公斤体重2微克IL4或IL13(每公斤TA肌肉2微克/公斤))。与抗炎作用一致，il4和il13处理的肌肉显示更少的间质细胞和浸润F4/80阳性(F4/80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)巨噬细胞，与对照肌肉相比(图1b-d)。出乎意料的是，当我们使用针对其c端(a.a.3667 -3671，编码于外显子77)[22]的MANDRA1抗体检测Dystrophin的表达时，我们发现IL4-和il13处理gydF4y2BamdxgydF4y2BaTA肌肉中MANDRA1含量显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维(>20%)较对照组gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉(0.6%;图1 e、f)。Western blot分析证实IL4-和il13处理后Dystrophin水平升高gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉裂解液(图1g,h)。使用埃文斯蓝染料(EBD)来评估膜的渗透性，我们确定IL4和il13处理的样品降低了EBDgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维，反映了肌纤维完整性的改善(图1i,j)。IL4和IL13的药代动力学评估显示了最强的影响(基于MANDRA1)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在2周和3周年龄组，两种ILs的影响均为2µg/kg，而在5µg/kg时，影响则有所下降。随着小鼠成熟(4-10周)，治疗效果逐渐降低。因此，IL4和IL13的早期干预可以减少炎症浸润，恢复肌营养不良蛋白gydF4y2BamdxgydF4y2Ba助教的肌肉。gydF4y2Ba

图1:IL4和IL13改善gydF4y2BamdxgydF4y2Ba病理和恢复Dystrophin的表达。gydF4y2Ba（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)检测方案图:2周龄TA肌肉gydF4y2BamdxgydF4y2Ba给小鼠注射IL4或IL13(右TA)和PBS(左TA)， 4周后收获;DOB，出生日期。（gydF4y2BabgydF4y2Ba野生型(WT)苏木精、伊红(H/E)染色切片gydF4y2BamdxgydF4y2Ba用PBS (+PBS)、IL4 (+IL4)和IL13 (+IL13)处理TA肌肉;箭头表示纤维化区域。（gydF4y2BacgydF4y2Ba)浸润巨噬细胞(箭头)用F4/80(绿色)免疫染色;DAPI染色细胞核(蓝色)。（gydF4y2BadgydF4y2Ba数据的量化(gydF4y2BacgydF4y2Ba)。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) MANDRA1免疫染色PBS-、IL4-和il13处理后的肌萎缩蛋白(绿色)gydF4y2BamdxgydF4y2BaTA肌(上);用DAPI染色的细胞核(蓝色)和底部合并图像。（gydF4y2BafgydF4y2Ba) dy的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(MANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)的数据。gydF4y2BaegydF4y2Ba)。（gydF4y2BaggydF4y2Ba) Western blot检测PBS-、IL4-和il13处理后的Dystrophin (Dys)gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉;野生型(WT)，以作比较;α-微管蛋白(α-tub)，负载对照。（gydF4y2BahgydF4y2Ba数据的量化(gydF4y2BaggydF4y2Ba)，归一化到α-tub。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba) PBS-、IL4-和il13处理后的EBD染色gydF4y2BamdxgydF4y2Ba助教的肌肉。（gydF4y2BajgydF4y2Ba) EBD的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba纤维(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。柱状图以均值±SEM表示(每组n = 3);** p≤0.001。比例尺= 50µm。gydF4y2Ba

通过RT-PCR，我们发现了多种剪接形式，可以排除突变的外显子，并预测il4 /13处理后的连续阅读框gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉(图2a)，表明突变的外显子23的跳过是营养不良蛋白恢复的基础。考虑到gydF4y2BaDMDgydF4y2Ba转录本的半衰期为~16 h[23]，外显子被跳过gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba在注射IL4/13数周后发现转录本，这些外显子跳过事件似乎持续存在。多种剪接变体预测多种营养不良蛋白异构体。为了检验这一点，我们使用gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba外显子特异性抗体MANDYS18(编码在e26中的表位)和MANEX4850A(编码在e48-50中的表位)[22]与MANDRA1一起。MANDYS18和MANDRA1双染色显示这些表位呈马赛克分布(图2b-d)，反映了Dystrophin的诱导gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba纤维表达不同的变异。MANEX4850A和MANDRA1双染色结果相似。随着抗肌萎缩蛋白的产生，抗strobrevin和Syntrophin也在治疗后的肌膜上得到恢复gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉(图2e-g)，提示功能复合体的形成。因此，IL4和IL13诱导外显子跳变来恢复Dystrophin及其相关蛋白gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌纤维膜。gydF4y2Ba

图2:IL4和IL13诱导多个帧内外显子跳过事件并恢复Dystrophin及其相关蛋白。gydF4y2Ba（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) RT-PCR检测到由IL4和IL13诱导的e22-24、e22-26和e22-45转录本，相对于pbs处理的TA肌肉;非跳过e22-23-24，输入控件。右侧总结剪接模式，MANDYS18和MANDRA1识别的表位位置。（gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba)用MANDYS18(红色)和MANDRA1(绿色)进行双重免疫染色的例子gydF4y2BabgydF4y2Ba) pbs -， (gydF4y2BacgydF4y2Ba) IL4-，和(gydF4y2BadgydF4y2Ba) IL13-treatedgydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉;DAPI染色的细胞核(蓝色);向右合并图像。星号表示MANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMANDYS18gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维;箭头,MANDYS18gydF4y2Ba^-gydF4y2BaMANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维;箭头,MANDYS18gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMANDRA1gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba肌纤维。注意肌纤维内表位分布不均。比例尺= 50µm。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) PBS、IL4-和il13处理后的免疫组化gydF4y2BamdxgydF4y2BaTA肌肉中含有抗反strobrevin和Syntrophin的特异性抗体。比例尺= 200µm。gydF4y2Ba

转录组分析显示，在IL4和il13处理中，共有200个上调基因和254个下调基因gydF4y2BamdxgydF4y2Ba与pbs处理的肌肉相比gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉。其中48个基因的表达与DMD患者和动物模型的表达趋势相反[24-28]，表明情况有所改善。正如IL4和IL13已知的作用所预期的那样，骨骼肌组织/纤维发育基因的大部分表达上调，而炎症基因的增加部分则被抑制。gydF4y2Ba

最近有报道称，全身注射IL2-Fc可改善乳腺癌的组织病理gydF4y2BamdxgydF4y2Ba肌肉[29]。我们受到启发，测试了系统的IL4-Fc是否可以恢复不同肌肉群中的营养不良蛋白。2周龄腹腔注射IL4-Fc和IL2-Fc(10µg/kg体重)gydF4y2BamdxgydF4y2Ba老鼠作为比较。4周后分析TA、横膈膜和腓肠肌。IL4-Fc治疗gydF4y2BamdxgydF4y2Ba小鼠含有明显更多的MANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与PBS-和il2 - fc处理组相比，所有3个肌肉组的肌纤维都有所增加(图3a-d)。Western blot分析证实Dystrophin水平增加(图3e-h)， EBD染色证实这些肌肉组的膜完整性增加。为了确定肌肉力量和阻力是否得到改善，我们评估了前肢举重能力(图3i)，并使用Kondziela的肌肉阻力和力量倒置测试(图3j)[30,31]。正如预期的那样，IL4-Fc处理组在两项测试中都比pbs处理组表现更好。gydF4y2Ba

图3:腹腔注射IL4-Fc可恢复Dystrophin，提高肌肉力量。gydF4y2Ba帷幕,老gydF4y2BamdxgydF4y2Ba分别腹腔注射PBS、IL2-Fc或IL4-Fc小鼠，4周后采集各组肌肉。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)用MANDRA1(红色)免疫染色TA、腓肠肌(Gast)和横膈膜(Diap)肌肉gydF4y2BamdxgydF4y2BaPBS、IL2-Fc和IL4-Fc注射小鼠;DAPI染色细胞核(蓝色)。（gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba) dy的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba切片中的纤维(gydF4y2BabgydF4y2Ba) ta， (gydF4y2BacgydF4y2Ba)加斯特，和(gydF4y2BadgydF4y2Ba) Diap，来自(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) PBS-和il4 - fc处理的TA、Gast和Diap肌肉中Dys的Western印迹gydF4y2BamdxgydF4y2Ba老鼠;α-微管蛋白(α-tub)，负载对照。每组三个生物重复显示，和WT样本，以供比较。（gydF4y2Baf-hgydF4y2Ba)从(gydF4y2BafgydF4y2Ba) ta， (gydF4y2BaggydF4y2Ba)加斯特，和(gydF4y2BahgydF4y2Ba)换肢肌，归一化至α-桶，以WT水平的百分比表示。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)前肢肌肉力量举重测试及(gydF4y2BajgydF4y2Ba) Kondziela的四肢肌肉力量和抵抗力倒置测试，用于PBS和il4 - fc处理gydF4y2BamdxgydF4y2Ba老鼠。这些分数以体重归一化。柱状图以均值±SEM表示(每组n =3);** p≤0.001gydF4y2Ba

我们接下来研究了IL4和IL13是否直接作用于gydF4y2BamdxgydF4y2Ba诱导成肌细胞gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba外显子跳跃。使用改进的成肌细胞招募方案[19]，我们分离出大约2周大的成肌细胞gydF4y2BamdxgydF4y2Ba用IL4或IL13在生长介质中处理48小时。然后将这些细胞暴露在分化培养基中72小时，并检测Dystrophin的表达。治疗gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞产生~50%的MANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单元格，同时控制gydF4y2BamdxgydF4y2Ba细胞显示约5-10%的自发恢复细胞(图4a,b)。肌原蛋白(MyoG)正常化后gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba核数(图4c)， IL4/13诱导mandra1的作用仍然存在。这一结果不太可能是增加的结果gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞如IL4/IL13的增殖仅表现出适度的有丝分裂活性(补充图S5b)。此外，e22-24加入gydF4y2BaDmdgydF4y2BaRT-PCR检测经IL4/ il13处理的成肌细胞转录本(图4d)。滴定数据表明，IL4和IL13的抗肌萎缩蛋白恢复活性分别在5和10 ng/ml时趋于稳定，与它们狭窄的有效剂量相比，在100 ng/ml时没有负面影响gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba．我们也证实了在我们的培养中PDGFRa的缺失gydF4y2Ba^！gydF4y2Ba纤维成脂祖细胞(补充图S5d)，一种间接促进肌肉再生的IL4靶细胞类型[21]。gydF4y2Ba

图4:IL4恢复抗肌萎缩蛋白的表达gydF4y2BamdxgydF4y2Ba和DMD成肌细胞的培养和移植后。gydF4y2Ba（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)主gydF4y2BamdxgydF4y2Ba对成肌细胞进行模拟处理(cont)或用IL4或IL13处理(检测方案见图S5a)，并对PBS-、IL4-和IL13处理的MANDRA1(红色)和MyoG(绿色)进行免疫染色gydF4y2BamdxgydF4y2Ba文化;DAPI染色的细胞核(蓝色);合并后的图像向右;箭头,MANDRA1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMyoGgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。比例尺= 30µm。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) MANDRA1的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(来gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)与DAPI重叠的信号gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba核来自(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。（gydF4y2BacgydF4y2Ba) MANDRA1的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(来gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)信号与MyoG重叠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba核来自(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。(gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba)，柱状图为均值±SEM (ngydF4y2Ba＝gydF4y2Ba每人3名);*gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.01，**gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.001。（gydF4y2BadgydF4y2Ba) RT-PCR检测IL4和IL13诱导的e22-24连接转录本;未跳过e22-23-24，输入控件。（gydF4y2BaegydF4y2Ba两种不同外显子缺失的人DMD成肌细胞系(Del.45，外显子45缺失;Del.45-51，缺失外显子45-51)按照(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和MANEX4850A(绿色)免疫染色Del.45线和MANEX5556A免疫染色Del.45-51线来自未处理(NT)、IL4-和il13处理的样品;DAPI染色细胞核(蓝色)。比例尺= 50µm。（gydF4y2BafgydF4y2BaRT-PCR检测到两株DMD成肌细胞中由IL4或IL13诱导的e44-46和e44-52连接转录本。（gydF4y2Bag-jgydF4y2Ba)经il4处理的(gydF4y2BaggydF4y2Ba)第45号及(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba4周后收获移植至NRG小鼠TA肌的Del.45-51成肌细胞，进行人特异性Spectrin(绿色)和DYS2(红色)免疫染色;DAPI染色的细胞核(蓝色);向右合并图像。DYS2在Spectrin+细胞中的百分比(gydF4y2BaggydF4y2Ba)及(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)在(gydF4y2BahgydF4y2Ba)及(gydF4y2BajgydF4y2Ba),分别;柱状图以均数±SEM表示(每组n = 3);** p≤0.001。比例尺= 50µm。gydF4y2Ba

qRT-PCR分析关键信号成分gydF4y2Ba的gydF4y2BaIL4和IL13显示(除了gydF4y2BaTyk2gydF4y2Ba) IL4RαgydF4y2Ba，gydF4y2BaJak1,gydF4y2BaJak2、Jak3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaStat6gydF4y2Ba2周时的表达水平高于3周时gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞，为年龄依赖性反应提供了一个可能的解释gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba．重要的是，营养不良蛋白的恢复gydF4y2BamdxgydF4y2BaIL4诱导的成肌细胞依赖于IL4Ra，当我们对IL4Ra进行siRNA敲低时，这种作用被取消gydF4y2BaIL4RagydF4y2Ba，与对照的打乱siRNA (gydF4y2BasiScrgydF4y2Ba)。我们还发现，通过药物抑制剂抑制JAK1和JAK2，可以抵消IL4诱导的肌萎缩蛋白逆转，为IL4信号在成肌细胞中的直接作用提供了额外的支持。我们进一步进行了RNA-seqgydF4y2BamdxgydF4y2Ba和IL4-treatedgydF4y2BamdxgydF4y2Ba并分析了其拼接模式。IL4没有引起整体mRNA处理模式的显著变化，这表明突变体存在外显子跳变gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba轨迹不是全局拼接更改的结果。gydF4y2Ba

我们将IL4应用于gydF4y2BamdxgydF4y2Ba在分化肌管中观察到Dystrophin逆转，我们询问IL4治疗是否有长期效果。为此，我们获得了备用细胞gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba，类似静止肌干细胞，由分化而来gydF4y2BamdxgydF4y2Ba最初未处理或再次用IL47处理的培养物，一直没有添加IL4。有趣的是,IL4-treatedgydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞在第二轮分化中保留了Dystrophin逆转表型。这预示着IL4/13治疗gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba也可以在很长一段时间内维持肌营养不良蛋白恢复的肌纤维。事实上，在单次肌肉注射IL4或IL13 30周后，发现了大量的MANDRA1+肌纤维。总之，我们得出结论，IL4，可能还有IL13，直接作用于gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞诱导长期肌萎缩蛋白逆转表型。gydF4y2Ba

为了开始评估IL4/13作为DMD治疗的可行性，我们探索了IL4和IL13的外显子跳过/营养不良蛋白恢复活性是否对DMD患者来源的永生化细胞系[33]有效。我们选择了来自于幼虫的两个系，代表了经常缺失的基因组区域gydF4y2BaDMDgydF4y2Ba、Del.45和Del.45-51。用IL4或IL13处理，诱导分化，检测抗肌萎缩蛋白。对于Del.45系，使用MANEX4850A[22]进行评估(图4e)，对于Del.45-51系，使用MANEX5556A[22](编码于外显子55-56中的表位;Fig.ure 4 e)。这些表位在未处理(NT)细胞系中未检测到，但在IL4处理后存在。奇怪的是，IL13诱导了MANEX4850A表位在Del。e45 line, but not the MANEX5556A epitope in the Del.45-51 line. RT-PCR data confirmed e44-46 and e44-52 joined transcripts in IL4-treated Del.45 and Del.45-51 lines, respectively, and e44-46 joined transcripts in IL13-treated Del.45 line (Figure 4f).

最后，我们测试了il4处理的Del.45和Del.45-51细胞异种移植到冷冻损伤的NRG小鼠TA肌肉中是否会产生DystrophingydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维。移植一个月后，我们发现了人类特异的SpectringydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肌纤维来源于移植的Del.45细胞(图4g)和Del.45-51细胞(图4i)，与治疗无关。在Spectrin内部gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba面积，DYS2明显增多gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与未处理的Del.45(图4g,h)和Del.45-51(图4i,j)细胞相比，il4处理的细胞中发现了肌纤维。因此，il4处理的DMD细胞系显示Dystrophin表达恢复gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的研究定义了IL4和IL13的新作用，并将它们的功能储备扩展到免疫反应[18]之外gydF4y2Ba，gydF4y2Ba成肌细胞招募/肌肉再生[18-20]，棕色脂肪形成[34]。有趣的是，我们发现IL4/13治疗对幼年动物和成肌细胞最有效。我们提出IL4/13利用发育窗口影响pre-mRNA剪接模式的长期变化。当IL4诱导外显子跳跃事件围绕的中间外显子gydF4y2BaDmd /模式gydF4y2Ba与反义寡核苷酸或CRISPR针对每个患者所需的特定设计相比，它可能在更大的患者队列中具有广泛的应用。与目前使用转基因、干细胞、寡核苷酸和CRISPR的策略相比，IL4和IL13是天然的生物分子，并且IL4的安全性已在临床试验中得到证实[5,6]。IL4/IL13如何诱导突变的外显子跳变gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba小鼠和人类患者成肌细胞中的基因座仍然是一个有待回答的有趣的开放问题。因此，我们敦促专攻DMD的临床团队考虑快速跟踪这一过程，并开始将我们的方法应用于患者的试验。gydF4y2Ba

C57BL / 10,gydF4y2BamdxgydF4y2BaNRG小鼠(杰克逊实验室)被安置在无病原体的设施中。所有动物实验均经IACUC批准。PBS、IL4和IL13 (R&D系统)经肌肉注射。IL2-Fc, IL4-Fc (AdipoGen Life Sciences)和Evans Blue染料(EBD, Sigma)经腹腔注射。NRG小鼠被用作人DMD成肌细胞的移植受体。动物的年龄和肌肉样本的采集时间线在文本和图例中指定。gydF4y2Ba

肌肉样本的处理gydF4y2Ba

肌肉样本在8µm冷冻切片。对于组织学或免疫荧光，切片用4%多聚甲醛(PBS)固定，并分别进行hematoxilin & eosin (Surgipath)染色或一抗和二抗孵育，如[35]所述。为了便于EBD染色，切片固定在冷丙酮中(-20°C)。抗体来源和稀释在补充信息中有详细说明。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

肌肉蛋白提取物如[35]所述制备，并通过SDS-PAGE(4-20%梯度凝胶，Bio-Rad)进行拆分，然后使用指定抗体进行Western blotting和ECL检测(GE Healthcare)。gydF4y2Ba

原代成肌细胞培养gydF4y2Ba

原代成肌细胞如所述[18]分离，并在Matrigel (BD Biosciences)涂层培养皿或载玻片上培养。PBS、IL4或IL13直接加入生长培养基。培养物洗净，在分化培养基中孵育72 h，用于免疫染色、蛋白提取;RT-PCR或RNA-seq。储备细胞通过部分胰蛋白酶化[32]分离4天分化培养。siRNA转染使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)。JAK1-3抑制剂(Calbiochem)在加入IL4前6小时和整个培养期间使用。成肌细胞增殖使用Cell Titer 96水溶液细胞增殖检测试剂盒(Promega)。gydF4y2Ba

RNA提取、RT-PCR、巢式RT-PCR、定量PCR (qPCR)gydF4y2Ba

使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取TA样品和培养细胞的总rna，用于RT-PCR、qRT-PCR或RNA-seq。外显子跳跃gydF4y2BaDmdgydF4y2Ba使用嵌套引物检测帧内拼接事件来检测转录本。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。qPCR采用BioRad CFX96实时系统和CFX管理器进行。gydF4y2Ba

肌肉力量gydF4y2Ba

进行Kondziela测试和举重测试以评估力量、阻力和运动能力[30,31]。按体重计算评分并归一化。gydF4y2Ba

人类DMD永久细胞培养和移植gydF4y2Ba

人DMD细胞系在骨骼肌细胞生长培养基(Promocell)中保存。IL4和IL13(研发系统)处理与对照组相同gydF4y2BamdxgydF4y2Ba成肌细胞。移植，5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞注射入NRG免疫缺陷小鼠[33]的TA肌。gydF4y2Ba

RNA测序和生物信息学gydF4y2Ba

对于每个RNA-seq数据集，使用3个独立的样本。RNA的纯度和完整性由nanodrop ND-100 (nanodrop)和Bioanalyser 2100 (Agilent)进行评估。利用Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2构建cDNA文库，HiSeq2000测序;100个核苷酸单次读取，每个样本约4000万次读取。采用Bowtie2 v 2.0.6, TopHat v 2.0.7和Cufflinks version 2.02计算归一化读计数(FPKM)。对折叠变化≥2、富集评分≥1的上调和下调基因采用DAVID功能注释聚类进行功能分析。Quantas管道用于分析RNA-Seq数据中的替代剪接信息。gydF4y2Ba

所有图像都是由安装在Axioscope上的AxioCam拍摄的。信号强度仅在必要时根据ORI数据处理指南进行调整。没有定量声明基于荧光强度的差异。gydF4y2Ba

除非另有说明，结果以均数±sem表示。使用Excel进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba-value小于0.05为显著值。gydF4y2Ba

所有测序数据已存入NCBI Sequence Read Archive (SRA)，项目编号PRJNA414242(待发布)。gydF4y2Ba

我们感谢E. Dikovskaia和S. Satchell的技术支持，感谢A. Pinder和F. Tan的RNA-seq，感谢M. Sieber、S. Southard和Fan实验室成员的评论。我们特别感谢V. Mouly博士提供的DMD不朽细胞系和Glenn Morris博士提供的抗体。卡内基科学研究所和美国国立卫生研究院(NIH)国家关节炎、肌肉和皮肤病研究所(AR060042 to c - m.f.)为这项工作提供了资金。sll是由国家卫生研究院资助的。gydF4y2Ba

S.L.和c.m.f.提出了这项研究的概念。S.L.进行了实验分析。sll和c.m。范策划、撰写、讨论、编辑稿件。gydF4y2Ba

作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者声明没有相互竞争的经济利益。gydF4y2Ba

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